Definição de Antígenos de Leishmania (L.) infantum para Utilização em Testes de Diagnóstico Rápido em Apoio à Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral

Departamento: DCB - DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Programa de pós-graduação: SAÚDE PÚBLICA

Linha: VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA

Grupo: VIGILÂNCIA DE BASE LABORATORIAL DE DOENÇAS INFECCIOSAS

Subárea de Conhecimento: 40602001

Descrição do projeto:
1- Introdução
1.1- Leishmaniose Visceral
A leishmaniose visceral humana, conhecida como calazar (peste negra) é causada por protozoários intracelulares da ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, gênero Leishmania. É uma doença importante, disseminada por áreas tropicais e subtropicais do mundo (Almeida et al., 2003b). A sintomatologia humana é variável, podendo ocorrer desde casos assintomáticos até o calazar clássico que se caracteriza por emagrecimento progressivo, caquexia, febre intermitente, mal estar, anemia, hepatoesplenomegalia, linfoadenopatia generalizada, anasarca, hipergamaglobulinemia e progressiva imunossupressão celular (Handman, 2001).
A transmissão ocorre através da picada da fêmea do vetor das espécies Lutzomyia longipalpis, Lutzomyia cruzi e Lutzomyia evansi, nas Américas e do gênero Phlebotomus das espécies P. perniciosus, P. ariasi, P. neglectus no velho mundo (Almeida et al., 2003b; Gomes et al., 2006). Diversos podem ser os hospedeiros vertebrados da leishmaniose visceral. Na Índia e no Sudão, a doença, que é causada pela L. (L.) donovani é uma antropozoose, transmitida de humano para humano, sendo estes especialmente infectivos durante a fase de calazar pós-dérmico (Rotureau, 2006). Em regiões do Mediterrâneo e nas Américas, a doença que é causada pela L. (L.) infantum / L. (L.) infantum, é uma zoonose de canídeos (leishmaniose visceral zoonótica). Recentemente através de caracterização molecular as duas espécies foram consideradas indistinguíveis (Awasthi et al., 2004; Gomes et al., 2006). Nos ambientes domésticos o cão apresenta-se como reservatório, já nos ambientes silvestres, canídeos silvestres como raposas e chacais servem de reservatório (Gramiccia & Gradoni, 2005). Ocasionalmente pode ocorrer a transmissão da doença por meios que não envolvam o vetor artrópode, por meio de transfusão sanguínea (Palatnik de Sousa et al., 1996), transplantes ou por via transplacentária (Moreira Jr et al., 2004). Em cães já está provada a transmissão via transfusão, prática cada vez mais freqüente na clínica veterinária, principalmente devido à falta de monitoramento de doadores (Freitas et al., 2006).
O parasito pode apresentar-se de duas formas diferentes durante o seu ciclo de vida: a promastigota ou forma extracelular, flagelada presente no vetor invertebrado e a amastigota, a forma intracelular sem flagelo livre, presente em células do sistema fagocítico mononuclear do hospedeiro vertebrado (Almeida et al., 2003b). O ciclo biológico tem início quando o vetor invertebrado se infecta durante a alimentação em indivíduo ou reservatório infectado. Junto ao sangue, ingere macrófagos infectados com os amastigotas, que serão liberados no estômago do vetor, onde se aderem se multiplicando até se transformarem em promastigotas, que migram pelo trato digestivo do inseto, multiplicando-se por divisão binária. As formas metacíclicas migram para região anterior do inseto e quando ocorrer a alimentação, serão transferidas juntamente com a saliva, que protege o parasito do sistema imunológico do hospedeiro. No hospedeiro vertebrado, os promastigotas, invadem os macrófagos e se transformam em amastigotas, multiplicando-se e rompendo essas células para invadir outras, espalhando-se assim pelo organismo do hospedeiro vertebrado (Awasthi et al., 2004).
1.2- Epidemiologia das leishmanioses
As leishmanioses são endêmicas em 88 países, existindo 350 milhões de pessoas em risco de contaminação. São estimados 2 milhões de casos novos ao ano e 12 milhões de pessoas infectadas (WHO, 2006). Desses 2 milhões, 500.000 casos novos anuais correspondem à leishmaniose visceral, que causa no mundo 59.000 mortes ao ano, o que somente é superado, entre as doenças parasitárias, pelas estatísticas da malária (Alvar et al., 2006). Atingem regiões da África, Índia, Américas (Central e Sul), Europa e Oriente Médio (Handman, 2001). Em regiões mais pobres, países em desenvolvimento, como Bangladesh, Afeganistão, Iran, Argélia, Arábia Saudita, Sudão, Bihar, Brasil e Peru, estão concentrados 90% dos casos registrados no mundo. Dentro desse contexto Bihar, na Índia, apresenta a maioria dos casos (Alvar et al., 2006).
No Brasil, a doença apresentava caráter rural. Em 1995, dos 3.783 casos de leishmaniose visceral registrados no Brasil, 3.417 foram notificados no nordeste, o que representou 90% da notificação nacional (MS-SINAN, 2003). Nos últimos dez anos, com a urbanização crescente, construção de estradas e migração da população, a doença vem mudando seu perfil para o de caráter peri-urbano e urbano. Em 2003, registram-se 3.279 casos, 64% deles na região nordeste, 14,1% na região norte, 8,2% na região centro-oeste e 13,6% na região sudeste, estando destacados, os estados de Minas Gerais, São Paulo, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, considerados novas áreas endêmicas e epidêmicas (MS-SINAN, 2003).
Essa adaptação e passagem de doença rural para urbana, associados a fatores de risco como: status imunológico (doenças imunossupressoras, alimentação inadequada) e tratamentos ineficientes, causando resistência dos parasitos (Dujardin, 2005), tornam a leishmaniose visceral uma doença de caráter emergente e um problema constante de saúde pública. Essa mudança ocorreu devido à variabilidade genética de vetores e hospedeiros envolvidos. Algumas espécies de flebotomíneos, não específicos para a doença, porém muito presentes nas Américas, L. (L.) shannoni e L. (L.) youngi, podem se infectar e transmitir o parasito, quando existe a disponibilidade de reservatórios infectados, transformando áreas não afetadas em endêmicas (Gramiccia & Gradoni, 2005).
1.3- Clínica na leishmaniose visceral canina
Os cães infectados podem apresentar diversas sintomatologias desde mais leves até mais graves, como podem apresentar também ausência de sintomas (revisado por Lima et al., 2004). Desta forma os cães infectados podem ser classificados como: assintomáticos (ausência de sintomas), oligossintomáticos (os cães apresentam de 1 a 2 sintomas) e sintomáticos (apresentam acima de 3 sintomas) (Abranches et al., 1991). Cães infectados com L. (L.) infantum, que apresentam quadro assintomático, resistem por longos períodos ou desenvolvem poucos sintomas podendo se curar espontaneamente (Scalone et al., 2002), tanto os casos de cães sintomáticos ou assintomáticos podem culminar na morte dos cães afetados (Reis et al., 2006). O período de incubação da doença canina é muito variável, podendo ocorrer de meses até anos após a infecção (revisado por Baneth & Aroch, 2007).
Os principais sinais presentes em cães doentes podem ser inespecíficos como febre por longos períodos, ou sinais clássicos e graves como a progressiva perda de peso até a caquexia. Lesões dermatológicas são as mais comuns manifestações descritas e incluem desde perda de pêlos localizada até generalizada e presença de úlceras de pele. Podem ser detectadas também: onicogrifose; lesões oculares como conjuntivite, ceratites e blefarites; glomerulonefrite devido ao depósito de complexos imunes; hepatite crônica devido à multiplicação de amastigotas em macrófagos com aumento do órgão, formação de granulomas em fígado e baço (Almeida et al., 2005a; Barrourim-Melo et al., 2006); linfoadenomegalia generalizada, observada clinicamente em linfonodos cervicais, poplíteos e esplenomegalia (Lima et al., 2004). Lesões clínicas ocorrem principalmente em órgãos ricos em células do sistema fagocítico mononuclear como fígado, rins, linfonodos, medula óssea, pele e trato gastrintestinal, geralmente com inflamação crônica (Lima et al., 2004). As co-infecções estão presentes em muitos casos (babesiose, erlichiose, parasitos intestinais, dirofilariose, leptospirose) sendo relatadas como comuns, agravando ainda mais o estado clínico do cão (Barrourim-Melo et al., 2006).
1.4- Resposta imune humoral na leishmaniose visceral canina
Na leishmaniose visceral canina é relatada a presença de uma forte resposta imune humoral. Cães infectados, apresentam níveis aumentados de anticorpos, principalmente da subclasse IgG, embora o aumento de imunoglobulinas, não esteja correlacionado a proteção (Pinelli et al., 1994) e sim a sintomatologia (Courtenay et al., 2002). Níveis altos de anticorpos IgG1 apresentam-se significativamente aumentados em cães infectados, estando correlacionado com a gravidade da doença, enquanto a IgG2 pode ser detectada em cães normais naturalmente resistentes a infecção, assintomáticos ou vacinados (Solano-Gallego et al., 2001). A resposta IgA, foi encontrada em altos níveis em cães que sofrem da doença de forma aguda, estando sua produção relacionada ao intenso parasitismo nos diferentes tecidos, pois é produzida quando o parasito se espalha por diferentes partes do corpo, inclusive mucosa. A resposta de IgM, ocorre de forma mais tardia, após aparecimento da resposta IgG, demonstrando não ser bom marcador de fase aguda (Rodríguez-Cortés et al., 2007). A gravidade da infecção por Leishmania evidenciada pela presença de DNA no sangue, está correlacionada com o aumento de sinais clínicos e com os aumentados títulos de IgA e IgM (Rodríguez-Cortés et al., 2007), IgG, IgG1, IgG2 (Rodríguez-Cortés et al., 2007; Courtenay et al., 2002). Mais recentemente foi demonstrado presença de resposta IgE em cães sintomáticos demonstrando a possível utilização como marcador ativo da doença (Almeida et al., 2005 a; Iniesta et al., 2005).
Foi demonstrada uma correlação entre presença de sinais clínicos, presença de parasitos com resposta de anticorpos fortemente soropositiva (Courtenay et al., 2002). Demonstrando que a detecção de anticorpos IgG anti-Leishmania mostra ser eficaz na identificação de cães infectados.
1.5- Controle da leishmaniose visceral
O Brasil é o único país endêmico para leishmaniose visceral que desenvolve um programa sistemático de controle epidemiológico e profilático desde 1980 (Palatnik de Sousa et al., 2001). Os métodos de controle utilizados no Brasil são: tratamento de casos humanos; eliminação de cães soropositivos; e controle de vetor em ambientes domésticos e peri-domésticos, com a utilização de inseticidas de efeito residual (Tesh 1995). A eutanásia de cães infectados não é aceita na Europa (Dye, 1996), sendo uma técnica de eficácia também discutida no Brasil (revisado por Palatnik de Sousa et al., 2001), tanto por razões éticas, sociais, como pelo baixo impacto na redução da transmissão (Dye, 1996, Courtenay et al., 2002, Gramiccia & Gradoni, 2005). A eutanásia de cães soropositivos é utilizada ainda, devido ao fato da quimioterapia para cães não ser recomendada pela Organização Mundial da Saúde, pelo crescente número de casos de resistência aos quimioterápicos observados em humanos (OMS, 1990).
A falta de eficácia do controle preconizado no Brasil se deve em parte à baixa sensibilidade do teste diagnóstico por imunofluorescência indireta realizada através de eluatos que são coletados a partir de sangue periférico dos cães embebidos em papel de filtro. É reconhecida a maior sensibilidade dos testes diagnósticos de ELISA sobre os de imunofluorescência indireta (Scalone et al., 2002) e do uso de soros em lugar de eluatos de sangue (revisado por Palatnik de Sousa et al., 2001). As normas do Ministério da Saúde no Brasil encontram-se em mudanças e recentemente, o método de ELISA é utilizado como diagnóstico de triagem e a imunofluorescência indireta como diagnóstico confirmatório, optando-se ainda, pelo uso de soros toda vez que a sua colheita e transporte for possível (MS-SINAN, 2003).
O tempo prolongado entre o diagnóstico e a remoção do cão infectado, a dificuldade de coleta do maior número possível de amostras caninas (Palatnik de Sousa et al., 2001; Courtenay et al., 2002; Moreira Jr et al., 2004) e a recusa dos donos dos cães na hora da remoção (Tesh, 1995), são dificuldades constantes no controle da doença no Brasil. Por todas as razões descritas, novas estratégias são necessárias para um controle efetivo e uma das principais seria o desenvolvimento de métodos diagnósticos mais sensíveis e específicos, levando em consideração principalmente à precocidade do diagnóstico no reservatório canino.
1.6- Diagnóstico da Leishmaniose visceral canina
O diagnóstico precoce da doença tem se mostrado útil no controle epidemiológico e na redução de casos humanos e caninos (Alvar et al., 2006). As técnicas de diagnóstico para a leishmaniose visceral canina se baseiam além dos sinais clínicos, em métodos parasitológicos, moleculares e imunológicos (Gomes et al., 2006). A detecção direta do parasita, ainda é o método de escolha para o diagnóstico (Chatterjee et al., 1999), embora alguns desses procedimentos ofereçam simplicidade, são caracterizados por serem invasivos, significando a ocorrência de riscos para os animais como também impraticáveis em programas de saúde pública, em que um grande número de animais necessita ser analisado num curto espaço de tempo. Trata-se de um método seguro de diagnóstico, que apresenta alta especificidade uma vez que o resultado positivo é dado pela observação direta das formas amastigotas. Entretanto a sensibilidade deste, depende do grau de parasitemia dos animais analisados, do tipo de material biológico a ser coletado e do tempo de análise dessas lâminas (MS-SINAN, 2003). As formas amastigotas podem ser detectadas através de material retirado de biópsias cutâneas, punções ou fragmentos de órgãos alvo como baço, fígado, medula óssea e de linfonodos cervicais e/ou poplíteos, corados pelo método de Giemsa ou hematoxilina e eosina (Boni et al., 1999). Para detecção do parasita são utilizados ainda, os métodos de amplificação por cultura in vitro de fragmentos ou aspirados de tecidos inoculados em meio NNN bifásico, ou ainda a cultura in vivo, em que material infectado é inoculado em modelos experimentais apropriados, normalmente hamsters (Boni et al., 1999). A procura direta do parasita em punção de linfonodos demonstra ser mais sensível em animais sintomáticos, com maior disposição de parasitas, quando comparados com os assintomáticos e oligossintomáticos que apresentam menos quantidade de parasitas em conseqüência da resposta imune mais efetiva (Pinelli et al., 1999). A imunohistoquímica pode ser utilizada como método complementar no diagnóstico (Lamothe et al., 2004), embora este método seja demorado e inapropriado para inquéritos epidemiológicos e seu uso ainda tenha eficácia muito discutida (revisado por Gomes et al., 2006).
O método molecular mais utilizado para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina é a reação de polimerase em cadeia (PCR), utilizada no diagnóstico de diferentes doenças parasitárias, incluindo a leishmaniose. É baseada na amplificação de seqüências específicas do parasito. É um método sensível, específico e rápido que pode ser utilizado em diferentes amostras biológicas, incluindo amostras de sangue, linfonodos, medula óssea e pele (Gomes et al., 2007).
Em áreas endêmicas o diagnóstico da doença é extremamente desafiador, devido à possível ocorrência de diversas e não específicas manifestações clínicas e a existência de uma grande quantidade de cães com alta soroprevalência em estado subclínico. Vale ressaltar também, que a soroconversão em cães naturalmente infectados ocorre em média 94 dias após a infecção (Courtenay et al., 2002) seguida de período latente de 105 dias, demonstrando que existe um período de 199 dias entre infecção e infecciosidade dos cães (Courtenay et al., 2002,). No caso da leishmaniose visceral canina este é um dado muito importante, pois o controle é realizado através de métodos de avaliação de anticorpos. A existência deste período de infecção inaparente nos cães pode acarretar falhas durante o inquérito epidemiológico. O diagnóstico sensível se torna então imprescindível.
As técnicas sorológicas utilizadas como método diagnóstico de escolha em inquéritos epidemiológicos, no Brasil, são o ELISA e a imunofluorescência indireta (MS-SINAN, 2003). Os métodos imunológicos se baseiam na detecção de anticorpos específicos anti-Leishmania nos soros dos cães infectados (Baneth & Aroch, 2007). Os testes sorológicos convencionalmente mais utilizados são a imunofluorescência indireta, teste da aglutinação direta, o ELISA e o western blotting (Lamothe et al., 2004). Existem ainda os testes imunocromatográficos, que se caracterizam por serem testes rápidos e de fácil execução, o diagnóstico se baseia na reação específica antígeno-anticorpo, que é visualizada através de coloração. Necessita de amostra de sangue total, sem a necessidade de separação de soro ou plasma, permitindo detecção de imunoglobulinas IgG ou IgM presentes no sangue do indivíduo a ser testado (Daikos et al., 2003; Verdida et al., 2005). Os métodos sorológicos demonstram especificidade e sensibilidade, o que é particularmente desejável para evitar resultados falso-positivos ou negativos, que podem levar a transmissão da doença ou a eutanásia desnecessária de um cão normal. Embora tenham sofrido avanços, são descritos ainda, problemas de reações cruzadas com outras doenças como: leishmaniose cutânea canina, doença de Chagas, erlichiose, rickettisiosis e toxoplasmose (Barrourim-Melo et al., 2006; Gomes et al., 2006; Ferreira et al., 2007), devido ao uso de antígenos crus por esta razão, métodos com níveis mais adequados de sensibilidade e especificidade são desejáveis. O uso de antígenos purificados de promastigotas tem sido cada vez mais estudado e utilizado e tem demonstrado sensibilidade e especificidade adequados no diagnóstico da doença (Gomes et al., 2006). São atualmente muito estudadas e usadas como método diagnóstico, as técnicas sorológicas que utilizam peptídeos recombinantes contendo epítopos específicos do parasito, obtidos através de clonagem de genes que codificam proteínas antigênicas (Scalone et al., 2002).
Devido à ocorrência em cães infectados, de uma correlação entre sintomatologia, infecciosidade e resposta fortemente soropositiva (Courtenay et al., 2002), os métodos sorológicos demonstram ser seguros e eficazes como métodos diagnóstico na leishmaniose visceral canina.
2- Objetivos:
Geral: Extração, purificação, caracterização e padronização de frações antigênicas provenientes de extrato bruto de antígeno de Leishmania (L.) infantum para a utilização em testes diagnóstico da leishmaniose visceral canina, nas plataformas Elisa, Imunofluorescência e Imunocromatografia.
Específicos:
1. Melhorar a especificidade e a sensibilidade nas plataformas, com o isolamento e padronização de frações antigênicas apropriadas.
2. Aperfeiçoar o teste de imunofluorescência por meio de nanotecnologia para o desenvolvimento de conjugados fluorescentes e pela utilização das frações antigênicas selecionadas.
3. Desenvolver um teste de Imunocromatografia para ser utilizado no diagnóstico de triagem da leishmaniose visceral canina, utilizando como antígeno as frações antigênicas selecionadas.
4. Realização de testes diagnósticos comparativos, por meio de avaliação de presença de parasitas e análise de DNA de leishmania por PCR.
3- Material e Métodos:
3.1- Crescimento e manutenção da cepa de L. (L.) infantum in vitro
A amostra de L. (L.) infantum, oriunda do setor de Imunodiagnóstico do Laboratório de Pesquisa e Serviços em Saúde Pública &8211; DCB &8211; ENSP - FIOCRUZ, será mantida através de repiques semanais de culturas de promastigotas, contendo meio bifásico NNN (fase sólida-37g/l de BHI, 2% de ágar e 5% de sangue desfibrinado de carneiro, fase líquida-3 ml Schneider&8217;s suplementado com 10% de soro fetal bovino). As culturas serão mantidas em estufa BOD a temperatura de 28&61616; C.
3.2- Obtenção do extrato bruto total
Com a finalidade de obtenção de massa celular, 5ml de culturas de promastigotas na fase logarítmica de crescimento serão transferidos para frascos Erlenmeyer de 1L contendo 200ml de meio Schneider&8217;s suplementado com 10% de soro fetal bovino, incubados sob agitação a 150 rpm a 280C por períodos de 3-4 dias. As culturas deverão ser ampliadas para frascos Erlenmeyer de 3 L contendo 1 L de meio Schneider&8217;s suplementado com 5% de soro fetal bovino e incubados nas mesmas condições. Em seguida, as células serão centrifugadas a 7000 rpm por 10 min. lavadas 3 vezes em solução salina (NaCl a 0,9%). A suspensão celular será submetida a lise celular por sonicação.
3.3- Obtenção, purificação e caracterização das frações antigênicas de interesse presentes no extrato bruto total

3.3.1- Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
O gel para separação das proteínas de interesse presente no extrato bruto total será efetuado segundo (Laemmli, 1970). As amostras serão aplicadas em um gradiente contendo 7-17 % de poliacrilamida com 1% de &8220;stacking&8221; gel. A eletroforese será realizada de 4-5h a 30mA com auxílio de uma fonte para eletroforese. Para a visualização de proteínas será utilizado Comassie Brillant Blue-R-250 em concentração final de 0,1% por 12h. e em seguida descorado com ácido acético 10% .

3.3.2- Análise das frações antigênicas de interesse presentes no extrato bruto total por Western Blot
Nesta etapa serão selecionadas as frações antigênicas apropriadas, contra as quais os cães infectados apresentem anticorpos e os cães normais não apresentem anticorpos. As proteínas do extrato bruto total separadas por SDS-PAGE serão transferidas para membranas de nitrocelulose seguindo modificação do método descrito por Towbin et al., (1979). Após a transferência, a membrana será corada com Ponceau 5% em solução de ácido acético 10%. As membranas serão lavadas com PBS-Tween 0,050% por 20 min. em agitação, seguido de bloqueio com PBS-Tween 0,3% caseína. Após será incubado com os soros a serem testados, diluídos em PBS-Tween 0,050% por 60 min. em agitação. Após lavagens, serão incubadas com anticorpo anti-IgG de cão conjugado a peroxidase, diluída em PBS-Tween 0,050%, por 60 min. Após lavagens, a revelação será realizada utilizando 100mM Tris-HCl, pH 7,4, contendo 0,5 mg/ml 3,3&8217; diaminobenzidina e 0,1% H2O2.
3.3.3- Purificação, caracterização e atividade imunológica das frações antigênicas de interesse presentes no antígeno bruto total
Os antígenos serão obtidos por cromatografia de exclusão molecular. As amostras obtidas serão submetidas a gel filtração por FPLC, usando 12 HR 10/30 (Amershan Pharmacia Biotech) e tampão fosfato 0,1M, pH 7,4. As amostras serão aplicadas no mesmo tampão e eluídas num fluxo de 0,25 ml/min. em frações de 1,25 ml. A quantidade de proteínas de cada fração será analisada pelo método de Lowry (Lowry et al., 1951). A quantidade de açúcar será determinada pelo método fenol/ácido sulfúrico (Dubois et al., 1956).
A presença de proteínas e açúcares presentes na estrutura das frações antigênicas de interesse serão determinadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (10% poliacrilamida), para visualização será utilizado método de coloração pela prata (Oakley et al., 1980). Para detecção de açúcar será utilizado o método de Schiff (Fairbanks et al., 1971). Para detecção de ácidos nucléicos será utilizado eletroforese em gel de agarose (0,5% agarose) na visualização será utilizado brometo de etídeo.
Após separação e caracterização das frações de interesse serão realizados ensaios de atividade imunológica. Na placa de petri será adicionado ágar gel duplo de difusão (1,1% ágar 0,4& NaCl). Na superfície do ágar duplo serão realizados picotes onde serão adicionadas amostras de soro teste (picote do centro) e amostras das frações antigênicas de interesse em torno (picotes laterais), ressuspendidas em solução contendo 50mM de acetato de sódio, 5 mM MgCl2, 5mM CaCl2, pH 6,0. Será testada a habilidade das frações antigênicas de precipitar as lectinas presentes no soro anti-Leishmania (Slutzky et al., 1979).
3.4- Padronização das frações antigênicas de interesse para a utilização Elisa, Imunofluorescência e Imunocromatografia.
3.4.1- Painel de soros utilizados
Para a padronização dos testes propostos para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina serão analisadas amostras soros de cães infectados, provenientes de área endêmica e soros de cães clinicamente normais, provenientes do Rio de Janeiro. As amostras de soros serão coletadas assepticamente da veia cefálica dos cães, em tubos sem anticoagulante. Os soros serão separados por centrifugação e conservados a -20ºC até a análise. Adicionalmente serão utilizados, soros de cães com leishmaniose tegumentar, doença de chagas, toxoplasmose, cinomose, sarna demodésica, dirofilariases, Babesia canis, Ehrlichia canis, Leptospira sp., Toxocara canis e Ancyslostoma caninum, para visualização de possíveis reações cruzadas.
3.4.2- Teste de ELISA
. As amostras coletadas serão avaliadas para presença total de anticorpos anti-frações antigênicas, utilizando placas de 96 poços de fundo chato (Corning 25805-96, cat número 430480, alta absorbância) que deverão estar previamente sensibilizadas com as frações antigênicas, incubadas a 37&9702;C por 1 hora e &8220;overnight&8221; a 4&9702;C. Posteriormente as placas serão lavadas cinco vezes em PBS (0,018M PBS pH 7,2, leite em pó desnatado Molico 1% e Tween 20 a 0,05%), adicionadas de soro canino diluído em PBS incubadas a 37&9702;C por 1 hora. Após lavagens será adicionado conjugado anticorpo anti-IgG de cão conjugado a peroxidase em PBS a 37&9702;C por 1 hora. Após lavagens, a revelação será realizada em tampão OPD (Na2HPO4 0,83M, ácido cítrico 0,33 M, pH 4,9-5,2, Orto fenileno diamina 0,05M, água oxigenada 7,5%) durante 30 minutos no escuro a temperatura ambiente. A reação será interrompida com 10 &956;l/poço de H2SO4 1N. A leitura será realizada em leitor de ELISA a 492 nm. Serão considerados positivos os animais que apresentarem valores acima do cutt-off a ser determinado utilizando os resultados dos animais soronegativos confirmados.
3.4.3- Imunofluorescência Indireta
O teste de imunofluorescência indireta será realizado seguindo uma modificação do método de Camargo & Rebonato (1969). O antígeno usado será obtido a partir de promastigotas na fase logarítmica. Após 48 horas de cultivo, os parasitos serão fixados em formalina a 5%, por 30min., seguindo então de, uma centrifugação à 2000 rpm por 10min. O pellet será ressuspendido em PBS, pH 7,2 e submetido à nova centrifugação, está operação será realizada por três vezes. Por fim, o pellet será ressuspendido em PBS. Serão utilizadas para análise 10 &61549;l da suspensão contendo 1,2x106 promastigotas/ml, adicionadas aos soros a serem analisados, previamente diluídos, Posteriormente, será realizada incubação utilizando anticorpo anti-IgG de cão conjugado com fluoresceína (Biomanguinhos, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil). Serão consideradas positivas as amostras que expressarem resultados positivos na diluição 1:40, na análise por microscopia de fluorescência.
3.4.4- Teste imunocromatográfico
O kit para o diagnóstico imunocromatográfico será produzido no projeto &8220;Desenvolvimento e validação de teste rápido imunocromatográfico para diagnóstico das leishmanioses&8221; numa cooperação técnica BIODEVICES/ENSP, financiado pelo CNPq, número do processo: 410571/2006-7. Será coletado na parte interna da orelha do cão uma gota de sangue, recolhida por meio de uma lanceta. A amostra de sangue deverá ser depositada na janela de amostra do dispositivo, com posterior adição do líquido eluidor/extrator. Após 5-10 min. serão analisados os resultados que são macroscopicamente evidentes. A reação positiva será determinada ao ser formado um complexo macromolecular colorido (linha) visível a olho nu, uma segunda linha de reação, determinada linha controle, para validação do teste.
3.5- Testes diagnósticos comparativos
3.5.1- Pesquisa de amastigotas em linfonodos
Linfonodos poplíteos ou cervicais serão puncionados com seringa e agulha fina. O material recolhido deverá ser analisado através de microscopia ótica, por meio de esfregaços em lâminas, corados pelo método de Giemsa para detecção de formas amastigotas.
3.5.2- Teste molecular (Reação de Polimerase em cadeia (PCR) para DNA de Leishmania)
Para análise de PCR, serão coletados em tubos com EDTA respectivamente amostras de sangue e aspirado de linfonodos. Para extração de DNA, serão utilizados 0,7 ml das respectivas amostras, que deverão ser lavadas com 0,5ml de tampão TE (10mM Tris e 1mM EDTA) centrifugadas a 14000 rpm e tratadas com tampão de lise (10% sódio dodecil sulfato-SDS em 0,2M acetato de sódio e 20&956;g/ml proteinase K) a 56&61616;C por 1 hora. O lisado será tratado com 400&956;l de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico, sendo o DNA precipitado em etanol, seco e ressuspendido em 50 &956;l de tampão TE. A análise de PCR será feita utilizando primers que amplificarão a região conservada do cinetoplasto (120bp) (Rodgers et al., 1990). A análise da amplificação será realizada em gel de agarose a 2% contendo 0,5&956;g/ml de brometo de etídio. Os géis deverão ser visualizados por meio de luz UV no transiluminador.
3.6- Análise estatística
A construção e a análise do banco de dados serão realizadas utilizando-se os programas Excel, Epi Info versão 6.04 e 2000 e NTSYS. Será realizada análise bivariada para comparação das freqüências e médias das variáveis utilizando-se o teste de qui-quadradro e o teste t de student com nível de significância de 5%.

Natureza:

• Desenvolvimento Tecnológico
• Pesquisa

Ano do início do projeto: 2007

Ano do fim do projeto: 2009

Coordenador: VALMIR LAURENTINO SILVA

Participante Externo:

• WALDEMIR DE CASTRO SILVEIRA

Participante Aluno:

• FERNANDA NUNES SANTOS