RISCO ZOONÓTICO DE ANIMAIS DOMÉSTICOS SUJEITOS ÀS INFESTAÇÕES POR ECTOPARASITAS EM ÁREAS DE DESENVOLVIMENTO INDUSTRIAL NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

Departamento: DCB - DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Programa de pós-graduação: não informado

Linha: EPIDEMIOLOGIA DE DOENÇAS TRANSMISSÍVEIS

Grupo: AMBIENTE, VETORES E SAÚDE PÚBLICA

Subárea de Conhecimento: 4.06.02.00-1

Descrição do projeto:
Metodologia:
Descrição da área de estudo
O estudo contemplará as áreas que estão sob a influência para a construção do complexo petroquímico do Rio de Janeiro: Itaboraí, São Gonçalo, Cachoeiras de Macacú, Casimiro de Abreu, Guapimirim, Niterói, Maricá, Magé, Rio Bonito, Silva Jardim e Tanguá.
Os municípios de Itaboraí, Cachoeiras de Macacú e Guapimirim já foram visitados em estudos prévios. Desta forma, será feito um retorno apenas nas localidades julgadas necessárias.
Os demais municípios serão visitados de maneira estratégica, com o objetivo de ter ao menos uma visita em localidades com diferentes características de ecótonos, a ser considerado: ambiente rural, ambiente urbano, silvestre e a interface entre eles.

Avaliação clínica dos animais e dados referentes à propriedade
A avaliação dos parâmetros clínicos como batimentos cardíacos, movimentos respiratórios e mucosas aparentes tem como a finalidade de se observar possíveis enfermidades que possam estar ocorrendo nos animais avaliados. Os dados coletados serão registrados em questionários individuais, onde constará nome do proprietário, endereço, cidade, número de pessoas residentes, propriedades rural e/ou urbana, presença cães e/ou equídeos com outros animais, número total de animais, data da coleta e situação sanitária (manejo, vacinação, vermifugação).

Coletas de sangue em equídeos e cães
Serão coletadas amostras de sangue dos eqüídeos e caninos das propriedades visitadas. As coletas serão realizadas por venopunção radial nos cães e jugular nos eqüídeos em tubos sem anticoagulante. Os soros serão aliquotados e armazenados a –20º C até o momento das análises preconizadas. O cálculo do número de amostras sanguíneas dos caninos e equinos terá como base a prevalência média de RGFM no estado do Rio de Janeiro e a população estimada desses animais em cada município, quando será realizado cálculo recomendado por Pereira, 2002.

Técnicas de diagnóstico laboratorial- Reação de imunofluorescência indireta (RIFI)
Esta técnica será utilizada para o diagnóstico de RGFM em caninos e equinos. Para proceder a técnica de RIFI, serão utilizadas lâminas de 12 orifícios marcadas com antígeno R.rickettsii. As lâminas serão gentilmente cedidas pelo Dr.Adriano Pinter, da Superintendência de Controle de Endemias (SUCEN). A diluição dos soros-teste e controle será de 1:64. Assim, 30μL dos soros-teste e dos controles diluídos em tampão salino fosfatado (PBS) serão dispostos em cada orifício das lâminas e armazenadas em câmara úmida em estufa bacteriológica a 370C, durante meia hora. Após este tempo, as lâminas serão lavadas com PBS, imersas por período de dez minutos no mesmo tampão e secas ao ar. Então, será adicionado 30μL de conjugado diluído em PBS e as lâminas armazenadas sob as mesmas condições por mais trinta minutos. Posteriormente, serão lavadas conforme descrito anteriormente e montadas com pequena gota de glicerina tamponada e cobertas por lamínula. A leitura das lâminas será realizada em microscópio de fluorescência a luz ultra-violeta com aumento de 40 vezes. Serão considerados positivos todos os orifícios que apresentaram pontos fluorescentes mais ou menos uniformes com formas cocóides, bacilares ou cocobacilares. Os soros-teste que apresentarem reatividade serão diluídos até chegarem a sua titulação máxima.

Coleta de ixodídeos e sifonápteros
Os carrapatos serão coletados dos ambientes, incluindo pastagens, áreas domiciliadas e em áreas primária, secundária e terciária de mata atlântica, além de investigações sobre os hospedeiros caninos e equídeos.
Para a coleta de ixodídeos do ambiente, serão utilizadas as técnicas de arrasto com flanela e armadilhas atrativas. O primeiro método consiste em arrastar uma flanela branca de 1,50m x 0,80m fixada a um suporte de madeira amarrada com uma corda ou barbante na extremidade anterior. A técnica do arrasto é indicada para locais com vegetação do tipo herbácea (gramíneas, leguminosas e outras forrageiras), utilizadas como áreas de confinamento de animais (pastos) e peridomicílio. Deve-se percorrer toda a extensão da área, andando lentamente e parando de tempo em tempo para a coleta dos ixodídeos.
Para o uso de armadilhas atrativas utiliza-se CO2 (gelo seco) como eficiente atrativo para os ixodídeos. Esta técnica consiste em colocar aproximadamente 500g de gelo seco em uma cavidade no solo e acima desta, uma flanela branca medindo 1,0m x 1,0m com fita adesiva dupla face nas bordas. O tempo de permanência deve ser de no mínimo uma hora. Estas armadilhas devem ser colocadas em locais com vegetação do tipo arbustivas e ou arbóreas como matas ciliares. Esta técnica é recomendada para a captura dos estágios adultos e ninfas. Os ixodídeos coletados dos animais domésticos serão removidos por leve torção manual ou retirados com auxílio de pinças lisas.
As capturas de pulgas ocorrerão no mesmo ambiente que os carrapatos e se dará a partir do uso de armadilha luminosa.
Os ectoparasitos capturados ficarão acondicionados em potes plásticos contendo álcool isopropílico que serão identificados de acordo com o local de procedência e data da coleta. A identificação dos espécimes de carrapatos se dará a partir das chaves dicotômicas de Aragão e Fonseca (1961) e na de Barros-Battestti et al. (2006). A identificação das espécies de pulgas seguirá Johnson 1957 e Linardi & Guimarães 2000.

Diagnóstico molecular de Rickettsia sp. e Yersinia pestis em ácaros e sifonápteros procedentes da Serra dos Órgãos, estado do Rio de Janeiro
Os ácaros e os sifonápteros procedentes da Serra dos Órgãos contemplam coleção do laboratório de vetores e foram identificados em estudos prévios (CARVALHO et al., 2001; SILVA, 2011). Estes ectoparasitas encontram-se armazenados em álcool 700 e serão preparados para a extração de DNA e posteriormente submetidos a PCR para o diagnóstico de Rickettsia sp. e da bactéria Y. pestis apenas em sifonápteros.

Reação em cadeia da polimerase (PCR)
A técnica de PCR será realizada em ectoparasitas para o diagnóstico de rickettsias e Y. pestis. Em uma etapa anterior à realização da PCR, os espécimes serão separados em pools de acordo com a espécie, fase evolutiva, sexo, animal fonte, data da coleta e localidade de procedência. Posteriormente, serão totalmente triturados com auxílio de uma ponteira estéril de 1 mL com a ponta queimada, que servirá de pistilo. Antes da etapa de trituração, os tubos tipo eppendorff estéril que contém os ectoparasitos ficarão imersos em nitrogênio líquido por dez segundos. Após esta etapa, o material ficará ressuspendido em 200 μL de solução tampão (PBS) e estocado a -20oC até o momento da extração de DNA.
Para a extração do DNA dos carrapatos será utilizado o Mini Kit QIAamp DNA (QIAGEN ®). Os pools formados serão submetidos à PCR utilizando dois conjuntos de iniciadores para o diagnóstico de RGFM: Rr190.70p/Rr190.602n (ompA) e RpCS.877p/RpCS.1258n (gltA) (REGNERY et al., 1991). Para o diagnóstico de Y. pestis serão utilizados os genes caf1 (GALYOV et al., 1990), Pla (SODEINDE et al., 1988), irp2 (GUILVOUT et al., 1993) e lcrV (MOTIN et al., 1992). As reações serão realizadas em termociclador programado com temperaturas e tempos padronizados para cada iniciador utilizado. Os produtos da PCR serão submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1%, corados com brometo de etídio e visualizados sob luz ultravioleta. Em caso de amplificação, o DNA será submetido à técnica de sequenciamento para a determinação da espécie.

Processamento dos dados e análise estatística
Será realizada análise exploratória dos dados do questionário através da descrição das frequências das informações sobre o proprietário e propriedade. Na análise de associação entre variáveis categóricas será empregado o teste exato de Fisher. Para a análise epidemiológica dos dados, serão calculados risco relativo e risco atribuível. Os dados dos ectoparasitos identificados serão avaliados quanto a diversidade, riqueza e intensidade parasitárias. Para a realização dos cálculos será utilizado o programa estatístico BioEstat 5.0 (AYRES et al. 2005).


Objetivo Geral:
- Avaliar o potencial das populações animal e humana para a ocorrência de Rickettsia sp. e Yersinia pestis em áreas de desenvolvimento industrial do estado do Rio de Janeiro.
Objetivos Específicos:
- Implantar no laboratório de vetores a rotina de técnicas aplicadas à biologia molecular, com a capacitação de recursos humanos;
- Conhecer a dinâmica ecológica das faunas de ixodídeos e sifonápteros nos ambientes rural, silvestre e urbano e dos animais domésticos (caninos e equinos) nos municípios sob influência da construção do Complexo Petroquímico do Rio de Janeiro;
- Investigar a infecção por Rickettsia sp. em ixodídeos e sifonápteros, por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), nos municípios sob influência da construção do Complexo Petroquímico do Rio de Janeiro;
- Investigar a presença de anticorpos anti Rickettsias do grupo da Febre Maculosa (RGFM) em caninos e equinos nos municípios sob influência da construção do Complexo Petroquímico do Rio de Janeiro;
- Investigar, em nível molecular, a ocorrência de Rickettsia sp. e Yersina pestis em ácaros e sifonápteros de roedores procedentes da Serra dos Órgãos, estado do Rio de Janeiro.

Natureza:

• Pesquisa

Ano do início do projeto: 2011

Ano do fim do projeto: 2014

Coordenador: RAIMUNDO WILSON DE CARVALHO

Participante Interno:

• ADRIANA HAMOND REGUA MANGIA
• ANTONIO NASCIMENTO DUARTE
• CELIA MARIA MARQUES DE BRITO
• MARCOS BARBOSA DE SOUZA
• NATHALIE COSTA DA CUNHA