Desenvolvimento e avaliação dos parâmetros sorológicos de teste rápido imunocromatográfico para o diagnóstico da tuberculose ativa

Departamento: DCB - DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Programa de pós-graduação: não informado

Linha: VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA

Grupo: VIGILÂNCIA DE BASE LABORATORIAL DE DOENÇAS INFECCIOSAS

Subárea de Conhecimento: 4.06.02.00-1

Descrição do projeto:
1. Identificação da proposta
Este trabalho se propõe a desenvolver e avaliar os parâmetros sorológicos de um método imunocromatográfico (IC) para detecção de anticorpos IgG anti-Mycobacterium tuberculosis em amostras sangüíneas, que permita o diagnóstico rápido da tuberculose humana.
A tuberculose é uma doença infecto-contagiosa de grande incidência no mundo e ocorre em maior proporção em populações de baixas condições socioeconômicas, entretanto, com o advento da AIDS e o Alcolismo, um novo perfil epidemiológico da doença parece começar a ser desenhado (OPAS/OMS, 2008). Esta doença, continua sendo uma das doenças crônicas mais importantes da história da humanidade, sobretudo nas áreas mais carentes do mundo. Apresenta-se com grandes repercussões sociais, pois acomete, predominantemente, a população adulta e produtiva. Estima-se que 1/3 da população mundial está infectada e com risco de desenvolver tuberculose (OPAS/OMS, 2008). A tuberculose ainda é responsável pela morte de 170.000 crianças a cada ano e atualmente é a principal causa de morte por doenças infecciosas entre adulto, em todo mundo, superando as mortes por AIDS, malária e outras. No ano de 1993 a OMS, reconheceu a gravidade do problema e classificou a tuberculose como uma situação de “endemia global”.
Historicamente vários eventos contribuíram para o atual panorama da tuberculose no mundo: a) a epidemia de HIV aumentou acentuadamente os casos de tuberculose, pois na fase inicial da doença AIDS a tuberculose não difere da forma usual de manifestação e de reação imunitária. Mas, na fase mais avançada, a diminuição dos linfócitos T CD4 compromete a ativação e o recrutamento de macrófagos (Silveira, 1999) resultando proliferação e disseminação de bacilos pela corrente sanguínea; b) a deterioração das condições socioeconômicas de parte da população mundial; c) a elevação da taxa de abandono do tratamento antituberculose; d) o aparecimento da multirresistência e e) a falta de interesse da comunidade científica e dos formadores de políticas públicas em relação à tuberculose (Fernandes et al, 1999).
O Brasil é um dos quatro países com maior número absoluto de casos de tuberculose no mundo. O total de casos em 2006, segundo o Sistema Único de Saúde (SUS) é de 78.834 casos. Estima-se que cerca de 50 milhões de Brasileiros encontram-se infectados. Na região Sudeste, concentram-se 47% (38.992) dos casos notificados. Na cidade do Rio de Janeiro, encontramos a maior taxa nacional: 120/100.000. As incidências foram de 83,4/100.000 hab. para tuberculose, em todas as formas, e de 39,4/100.000 hab. para casos bacilíferos (OPAS/OMS, 2008).
O diagnóstico da tuberculose deve ser estabelecido com base no reconhecimento dos sinais e sintomas clínicos sugestivos da doença e em dados epidemiológicos, por investigação laboratorial para demonstração do parasito nos tecidos pulmonares por meio de contagem microscópica do número de bacilos por lâmina (baciloscopia) e o crescimento do bacilo em meio de cultura (Mello, 2001).
As estratégias de vigilância e controle da tuberculose vêm sendo, fundamentalmente, o diagnóstico precoce da doença e o tratamento e acompanhamento dos casos. Após a OMS declarar a tuberculose em “estado de emergência” no mundo, novas metas foram traçadas para o controle da doença. As metas internacionais estabelecidas pela OMS e pactuadas pelo governo brasileiro são de descobrir 70% dos casos de tuberculose estimados e curá-los em 85%(OPAS/OMS, 2008).
O Programa Nacional de Controle da Tuberculose (PNCT) está integrado na rede de Serviços de Saúde. É desenvolvido por intermédio de um programa unificado, executado em conjunto pelas esferas federal, estadual e municipal. Está subordinado a uma política de programação das suas ações com padrões técnicos e assistenciais bem definidos, garantindo desde a distribuição gratuita de medicamentos e outros insumos necessários, até ações preventivas e de controle do agravo. Isto permite o acesso universal da população às suas ações.
Dentro dos parâmetros de controle da tuberculose foi desenvolvido o DOTS (sigla em inglês para Estratégia do Tratamento Supervisionado da Tuberculose) que é uma proposta de intervenção que aumenta a probabilidade de cura dos doentes em função da garantia do tratamento assistido, contribuindo para a interrupção da transmissão da doença. É uma estratégia de controle da tuberculose recomendada internacionalmente. Curar pacientes, salvar vidas, reduzir a transmissão e prevenir o aparecimento e disseminação da tuberculose. Com o DOTS, o paciente recebe a medicação e tem todo o seu tratamento observado pelos serviços de saúde. Na primeira fase (2 meses HRZ) de tratamento faz-se, no Brasil, um mínimo de três observações semanais e na segunda fase (4 Meses HR), uma observação semanal. (OPAS/OMS, 2008)

2. Objetivos
2.1 Objetivos gerais
• Desenvolver e avaliar os parâmetros sorológicos em um método imunocromatográfico (IC) para detecção de anticorpos IgG anti-Micobacterium tuberculosis no sangue, plasma ou soro, que permita o diagnóstico rápido da tuberculose humana.

2.2 Objetivos específicos
• Melhorar a qualidade do diagnóstico da tuberculose, principalmente da tuberculose infantil, com o emprego do IC utilizando anticorpos extraídos de ovos de galinha (IgY), que permitem ligações mais estáveis e de elevada avidez.
• Estimar os parâmetros sorológicos referentes à sensibilidade, especificidade, acurácia, reprodutibilidade e os valores de predição do IC para o diagnóstico da tuberculose, considerando formas clínicas e faixa etária.
• Comparar os resultados do IC com os obtidos por outras metodologias de diagnóstico (baciloscopia e cultura).

3. Metodologia
3.1 Design do dispositivo de imunocromatografia proposto
O dispositivo de imunocromatografia (DIC) é composto de uma membrana porosa de celulose modificada e membranas absorventes acessórias de fibra de vidro, contendo os elementos de reação, ajustadas em um invólucro plástico apropriado com uma janela para se acrescentar a amostra de teste e outra para leitura do resultado da reação.
A utilização do DIC é facilitada pela apresentação do kit que contém além do próprio dispositivo, os acessórios necessários à execução do teste, como os dispositivos de coleta (lanceta) e o líquido eluidor/extrator em frasco conta gotas. Basta colher a amostra do indivíduo sob testagem, por punção em um dos dedos das mãos e a seguir dispensa-se diretamente, apenas uma gota de sangue colhida na janela de teste, imediatamente dispensa-se 5 gotas do líquido eluidor/extrator. Aguardam-se alguns minutos (5 – 10 minutos) para leitura dos resultados macroscopicamente evidentes.
O princípio de funcionamento do DIC é simples, baseia-se na reação específica antígeno-anticorpo. Compõe-se de uma fase sólida (membrana porosa), onde estão imobilizados elementos de captura e uma fase móvel onde estão suspensos o conjugado de captura (micro-esfera de látex colorido-anticorpo) e a molécula alvo (amostra contendo a molécula alvo).
A fase móvel migra sobre a fase sólida por efeito de capilaridade, conduzindo o complexo formado entre a molécula alvo e o conjugado de captura, que será retido na linha de captura da fase sólida, formando um complexo macromolecular colorido visível ao olho humano. Caso a amostra não contenha a molécula alvo esta linha de reação não se formará. Uma segunda linha de reação, denominada de linha de controle se forma pela captura do conjugado livre, que permite a confirmação da migração da fase móvel.
O teste rápido proposto é um DIC para detecção de anticorpos anti- Mycobacterium tuberculosis em amostras sanguíneas, usando PPD como antígenos, e anticorpos policlonais anti-IgY como elementos de captura na fase sólida (linhas de captura), e um conjugado de IgY anti-imunoglobulina IgG anti- Mycobacterium tuberculosis da amostra sanguínea. A finalidade dos policlonais anti-IgY é o estabelecimento de uma linha de controle interno para revelar a migração da fase móvel por captura do conjugado de IgY.

Natureza:

• Pesquisa

Ano do início do projeto: 2008

Ano do fim do projeto: 2010

Coordenador: VALMIR LAURENTINO SILVA

Participante Interno:

• ANDRÉ REYNALDO SANTOS PÉRISSÉ

Participante Externo:

• WALDEMIR DE CASTRO SILVEIRA

Participante Aluno:

• ALONSO MARTINEZ MONTEIRO