Desenvolvimento e validação de teste rápido imunocromatográfico para diagnóstico das leishmanioses

Departamento: DCB - DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Programa de pós-graduação: SAÚDE PÚBLICA

Linha: VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA

Grupo: VIGILÂNCIA DE BASE LABORATORIAL DE DOENÇAS INFECCIOSAS

Subárea de Conhecimento: Ciências da Saúde

Descrição do projeto:
Objetivos gerais:
- Desenvolver e validar um método imunocromatográfico (IC) para detecção de anticorpos IgG anti-Leishmania no sangue total, que permita o diagnóstico rápido (Kits) das leishmanioses humana e canina em condições de campo.
Objetivos específicos:
- Implementar a produção de kits para diagnóstico “rápido” das leishmanioses humana e canina visando inquéritos sorológicos em triagem de campo.
-Melhorar a qualidade do diagnóstico por IC pelo uso da tecnologia de anticorpos extraídos de ovos de codorna (IgY), que permitem ligações mais estáveis e de elevada avidez, com eliminação de fatores de interferência importantes presentes nas amostras séricas, como fator reumatóide, complemento e anticorpos heterófilos.
- Desenvolver cooperação entre Instituição Científica e Tecnológica – ICT, empresa privada e inventor independente, conforme Lei no. LEI No 10.973, DE 2 DE DEZEMBRO DE 2004 e DECRETO Nº 5.563, DE 11 DE OUTUBRO DE 2005, agregando conhecimento e tecnologia entre, Waldemir Silveira (Inventor Independente), instituições de pesquisa (ENSP-FIOCRUZ) e micro-empresa privada (BIODEVICES - RJ) que tem como propósito o desenvolvimento tecnológico e inovação de kits para diagnósticos in vitro e implementar a avaliação contínua da eficácia e segurança dos kits desenvolvidos.

Metodologias:
Design do dispositivo de imunocromatografia proposto (plataforma proposta):
O dispositivo de imunocromatografia (DIC) é composto de uma membrana porosa de celulose modificada e membranas absorventes acessórias de fibra de vidro, contendo os elementos de reação, ajustadas em um invólucro plástico apropriado com uma janela para se acrescentar a amostra de teste e outra para leitura do resultado da reação.
O princípio de funcionamento do DIC é simples, baseia-se na reação específica antígeno-anticorpo. Compõe-se de uma fase sólida (membrana porosa), onde estão imobilizados elementos de captura e uma fase móvel onde estão suspensos o conjugado de captura (micro-esfera de látex colorido-anticorpo) e a molécula alvo.

Obtenção de antígenos:
Formas promastigotas de Leishmania braziliensis e de Leishmania chagasi cultivadas e expandidas em ShneiderŽs Drosophila Medium, complementado com soro fetal bovino, com 7 dias de crescimento serão sedimentadas por centrifugação. O sedimento será submetido a sonicação até o rompimento total das formas promastigostas. O extrato obtido será centrifugado subseqüentemente para obtenção de sobrenadante contendo antígenos parcialmente solúveis, que serão purificados por processo cromatográfico e depois de caracterizados serão aplicados ao suporte imunocromatográfico.

Obtenção da imunoglobulina Y (IgY) espécie específica:
Um grupo de codornas (Coturnix coturnix japonica) serão imunizadas com 50 µg de IgG e IgM (humano ou canino) separadamente por meio de inoculo único no músculo peitoral, seguindo-se as normas e aprovações ditadas pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA). Após um intervalo de 40 dias os ovos colhidos serão processados, separando-se a gema, que é tratada com uma solução precipitante de polietilenoglicol (PEG) e cromatografia em gel, para a extração da IgY.

Microesferas de látex:
Serão produzidas por meio de polimerização emulsiva, conforme descrito por (Ma et al., 1999 (a) e (b) Ma et al., 2003) e de acordo com modificações de propriedade privativa do proponente.

Membrana suporte:
Será produzida a partir de papel de celulose modificado por polimerização a base de monômeros vinílicos.

Imobilização nas microesferas de látex - Conjugados:
A IgY obtida é colocada em contato com uma suspensão ativada de micro-esferas coloridas, que reagem com a fração Fc do anticorpo por interação hidrofóbica, ocorrendo neste momento a conjugação. O produto resultante é purificado por centrifugação.

Avaliação da performance do dispositivo:
Serão executados paralelamente testes tradicionais de imunofluorescência indireta e imunoensaio ELISA para comparação e validação.

Natureza:

• Desenvolvimento Tecnológico

Ano do início do projeto: 2006

Ano do fim do projeto: 2008

Coordenador: VALMIR LAURENTINO SILVA

Participante Interno:

• ELIZABETH GLORIA OLIVEIRA BARBOSA DOS SANTOS

Participante Externo:

• WALDEMIR DE CASTRO SILVEIRA